As microcápsulas de gel de agarose permitem fácil

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 17014 (2022) Citar este artigo

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Um novo tipo de microcápsula de gel de agarose (AGM), consistindo de um núcleo de picolitro de alginato e um invólucro de gel de agarose, foi desenvolvido para obter DNA genômico de bactérias amplificado de célula única e alta qualidade. O AGM é fácil de preparar em uma emulsão estável com óleo de densidade equivalente à água, o que evita a agregação do AGM, apenas com equipamento de laboratório padrão. Células únicas de uma cultura pura de Escherichia coli, uma comunidade simulada compreendendo 15 cepas de bactérias intestinais humanas e uma comunidade bacteriana intestinal de cupins foram encapsuladas em AGMs, e suas amostras de DNA genômico foram preparadas com amplificações massivamente paralelas em um tubo. O sequenciamento do genoma não precisou de amplificação de segunda rodada e mostrou uma completude média do genoma muito maior do que a obtida usando um método de amplificação convencional na escala de microlitros, independentemente do conteúdo genômico de guanina-citosina. Nosso novo método usando AGM permitirá que muitos pesquisadores realizem genômica de célula única de maneira fácil e eficaz e pode acelerar a análise genômica de microorganismos ainda não cultivados.

Os microrganismos estão distribuídos de forma ubíqua em diversos ambientes. Eles são frequentemente associados a outros organismos e desempenham papéis importantes nos ecossistemas. No entanto, a maioria das espécies microbianas são difíceis de cultivar com métodos convencionais e são chamadas de microrganismos ainda não cultivados1. Nas últimas duas décadas, eles foram extensivamente estudados usando métodos independentes de cultura, como análise de sequenciamento de amplicon de genes de RNA ribossômico de subunidade pequena (SSU rRNA) e análise de sequenciamento shotgun de metagenomas. A metagenômica é uma ferramenta poderosa para investigar as funções ecológicas e fisiológicas da microbiota com base em seus repertórios genéticos codificados. O desenvolvimento recente do binning computacional de fragmentos metagenômicos em respectivos conjuntos taxonômicos microbianos reforçou a utilidade da metagenômica2,3. No entanto, binning computacional com base na composição da sequência, homologia para sequências de banco de dados e cobertura de leitura de sequência de cada fragmento pode muitas vezes falhar em discriminar genomas de (sub)espécies intimamente relacionadas e classificar corretamente regiões genômicas que exibem características distintas de outras, como rRNA genes, profagos e plasmídeos4,5. Além disso, é necessário um grande esforço de sequenciamento para obter as sequências do genoma de espécies menores na comunidade microbiana3.

A genômica unicelular, na qual todo o DNA genômico é amplificado a partir de células isoladas fisicamente6, tem sido utilizada como método alternativo ou complementar para revelar a capacidade metabólica de microorganismos ainda não cultivados1,7. O isolamento de célula única pode ser alcançado em muitos casos usando tecnologias como seleção de células ativadas por fluorescência (FACS)1, micromanipuladores8, dispositivos microfluídicos9,10 e encapsulamento em gotas de água em óleo11. Embora vários métodos para amplificação do genoma inteiro tenham sido desenvolvidos12, a amplificação por deslocamento múltiplo (MDA) usando phi29 DNA polimerase com iniciadores aleatórios é mais amplamente utilizada devido à sua relativa simplicidade, confiabilidade e aplicabilidade6,13. No entanto, o MDA demonstra inerentemente um viés de amplificação extremo entre as regiões do genoma1, que tem sido a principal limitação técnica na genômica de célula única. Além disso, o alto conteúdo de guanina-citosina (GC) do DNA genômico tende a aumentar o viés de amplificação1,14. O viés de amplificação pode ser suprimido usando pequenos vasos de reação; por exemplo, câmaras de microcanais (60 nL)10, micropoços de nanolitros (12 nL)15, microfluídica virtual (MDA em uma folha de gel, 60 nL)16, gotículas digitais geradas usando um microcanal (9,5–240 pL)17,18, 19 e esferas de gel20. No entanto, essas técnicas de microfabricação não estão disponíveis para muitos microbiologistas, e a quantidade do produto de amplificação geralmente é muito pequena para o sequenciamento direto do genoma; portanto, uma segunda rodada de MDA é frequentemente necessária, o que acaba por aumentar o viés de amplificação21.